S. Dochi and D. Goldstein, Tagra Biotechnologies Ltd. SOFW Journal, 140, 8-2014.

摘要

视黄醇在调节上皮细胞生长和分化中发挥着重要作用；它能刺激胶原蛋白生成、加速细胞繁殖并使皮肤角质化恢复正常，从而使皮肤看起来更年轻、更通透、更健康。然而，尽管视黄醇是护肤品中最受欢迎的成分之一，但其众所周知的易不稳定性给产品开发人员带来了一定问题，并给护肤配方带来了许多挑战。

在本文中，我们描述了使用溶剂萃取法制备视黄醇微胶囊的过程，以在确保其功效的同时提高视黄醇的稳定性。我们对视黄醇微胶囊的物理化学性质、稳定性和功效进行了研究。

成熟的微胶囊制造方法制备出了载有 7% 视黄醇、平均粒径为 35 µm 的球形微胶囊。获得的稳定性结果表明，与游离视黄醇相比，使用微胶囊包裹的视黄醇进行配方时，视黄醇的平均相对含量显著更高。此外，体内临床研究清楚地表明，包裹过程确实保留了视黄醇作为抗衰老/抗皱剂的皮肤学活性。

引言

近年来，作为健康生活方式趋势的一部分，消费者越来越意识到活性成分对皮肤健康的好处 (1, 2)。因此，化妆品配方设计师不断寻求创新机会，通过使用各种独特的活性成分来设计新的护肤产品，如维生素、多肽、精油和抗氧化剂，这些成分都可以改善皮肤健康、保持其年轻光彩并预防皮肤问题 (3)。

此类创新产品给化妆品行业带来了新的挑战，因为这些活性成分大多在加入化妆品配方后容易发生降解，导致活性丧失。暴露于热、极端 pH 条件、氧化剂以及与配方中其他成分的不相容性都可能导致功效不足和稳定性降低，从而最终损害消费者的忠诚度。

为了克服这些配方挑战并为配方设计师和产品开发人员提供他们所寻求的技术优势，人们正在使用不同的递送系统。通过使用递送系统，配方设计师可以通过稳定活性成分、使不相容的成分共存于同一配方中并提供靶向递送以增强效果，从而增强个人护理或化妆品配方的功能。

微胶囊化是一种保护活性成分使其免受周围环境影响并提高其稳定性的常用技术，它可以控制并决定活性成分在最终应用中的释放 (4, 5)。本研究的目的是提高视黄醇的稳定性，确保其有效递送，并保留其在化妆品应用中的治疗效果。

视黄醇是维生素 A 的一种形式。它在调节上皮细胞生长和分化中发挥着重要作用；它刺激胶原蛋白生成，加速细胞繁殖，并使皮肤角质化恢复正常。已发现它是治疗光老化、寻常痤疮、银屑病和皱纹等不同皮肤病症和皮肤障碍的有效方法 (6, 7, 8, 9)。视黄醇可显著改善皮肤弹性、平滑度和柔软度，使皮肤显得更年轻、更通透、更健康。

虽然视黄醇是护肤品中最受欢迎的成分之一，但其众所周知的不稳定性 (10, 11) 给产品开发人员带来了一定问题，并给护肤配方带来了许多挑战。人们设计了各种递送系统（如脂质体、胶束、乳液和脂质纳米粒）来提高视黄醇的稳定性 (12, 13, 14)，但成功有限。

在本文中，我们描述了通过 Tagra Biotechnologies 的专利微胶囊技术制备名为 Tagravit™ R1 的视黄醇微胶囊。我们对这些视黄醇微胶囊的物理化学性质、稳定性和功效进行了研究。

材料与方法

Retinol 5°C 购自 BASF。聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 和聚乙烯醇 (PVA) 购自 Sigma。1,2,3-三辛酸甘油酯（三辛酸甘油酯/tricaprylin）购自 Abitec。二丁基羟基甲苯 (BHT) 购自 Lanxess GmbH。使用的所有其他试剂均为高纯度或 HPLC 级。

Tagravit™ R1 微胶囊的制备

采用溶剂萃取法制备了含有视黄醇的 Tagravit™ R1 微胶囊 (15, 16)。通过将 PMMA 溶解在有机溶剂中以形成均匀的聚合物溶液来制备微胶囊。在混合过程中将视黄醇加入到聚合物溶液中，然后向有机相中加入三辛酸甘油酯和 BHT。

将有机相与含有 0.2% PVA 的水相混合并搅拌以形成乳液。将乳液转移到萃取水相中。在此阶段，由于有机溶剂的萃取，液滴随后固化成坚硬的微胶囊。微胶囊沉降后，通过过滤收集并用水洗涤以去除任何杂质。使用冷冻干燥法干燥 Tagravit™ R1 微胶囊以获得自由流动的粉末。

视黄醇含量、包封率和产率的测定

使用配有可变紫外检测器的 JASCO HPLC UV-975 系统（JASCO Analytical Instruments，日本）通过反相高效液相色谱法对视黄醇进行定量。使用 Eurospher-100 色谱柱（4 nm，25 cm × 4 mm 内径）进行分离，流动相为含有 95% v/v 甲醇和 5% v/v 四氢呋喃 (THF) 的等度洗脱，流速为 1.0 ml/min。在 325 nm 处检测视黄醇。

称取 40 mg Tagravit™ R1 微胶囊并溶解在 5 ml 二氯甲烷 (DCM) 中，然后用甲醇适当稀释。过滤后的样品通过 HPLC 进行分析。微胶囊中的视黄醇含量 (w/w %) 定义为微胶囊中测得的视黄醇含量除以微胶囊重量。使用以下公式计算包封率：

包封率 = 测定含量 / 理论含量 × 100

通过 %产率 = W/Wo × 100 确定并计算生产产率，其中 W 为微胶囊的重量，Wo 为视黄醇、BHT、三辛酸甘油酯和聚合物的总预期重量。

粒径与形态学表征

使用 HORIBA LA-300 激光衍射粒度分布分析仪（HORIBA Ltd.，日本）分析微胶囊的粒径和粒径分布。每次测量前，微胶囊均悬浮在软去离子水中。所有测量均在 25°C 下以恒定散射角（六个广角检测器）进行。所有数据分析均在自动模式下执行。

通过扫描电子显微镜（SEM 505，Philips，埃因霍温，荷兰）对 Tagravit™ R1 微胶囊的形貌进行了表征。用于 SEM 观察的样品制备方法为：使用双面胶带将微胶囊直接安装在 SEM 载网架上，在减压下镀铂，然后放入扫描电子显微镜（Magellan™ 400L）中。

稳定性研究

对 Tagravit™ R1 的稳定性进行了评估，并与游离视黄醇进行了比较。通过随时间测量视黄醇含量（初始含量的 %）来评估稳定性。此外，通过对含有 Tagravit™ R1 或游离视黄醇的配方进行物理观察，定性评估产品稳定性。

将包裹视黄醇和游离视黄醇加入水包油 (o/w) 基础面霜和水凝胶基质配方 (pH 7.3) 中，在避光的密闭玻璃容器中于 4°C、25°C 和 40°C 下培养。

为了测定配方中的视黄醇含量，采用了以下萃取方法。称取面霜和凝胶样品 (2 g)，与 5 ml DCM 混合搅拌 2 分钟使其溶解，然后在 25°C 下以 6K rpm 离心分离 5 分钟。取出上清液并转移到单独的容器中。重复萃取程序两次。收集的上清液用适量甲醇稀释。所有样品均经过滤并用 HPLC 进行分析。

体内功效测试

进行了一项随机盲法临床研究，以评估包裹视黄醇的抗衰老活性。该临床研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。该研究采用人体皮肤快速光学体内表面形貌测量法 (FOITS) 技术进行 (17, 18)。

受试者根据随机分组，每天两次使用基础晚霜 (n=28) 或含有视黄醇微胶囊的基础晚霜 (n=25)，持续四周。28 名受试者作为未接受任何治疗的阴性对照。在此项研究期间，不允许参与者使用额外的化妆品。

测试了眼周区域（每个受试者两个区域）。每个测试区域分为五个子区域，从较明显的皱纹（鱼尾纹，区域 1）到较不明显的形貌（离眼睛较远，区域 5）。测定了两个参数以分析眼周区域的形态结构：Rz（粗糙度平均深度）和 Ra（算术平均粗糙度）(19)。

为了评估视黄醇对皮肤轮廓的潜在影响，以 5 µm 的间隔计算了基线和终点值在 -600 µm 至 +600 µm 范围内的深度频率分布 (FDD)。深度的各区间代表微观结构 (0-50 µm)、精细结构 (55–170 µm) 和粗糙结构 (>170 µm)。如果在较高深度（>170 µm：粗糙结构）处发生减少，而在较低深度（<170 µm：精细结构）处测得 FDD 增加，则可得出具有正面效果的结论。

结果

微胶囊表征

成熟的微胶囊制造方法制备出了含有 7% 视黄醇的微胶囊，生产产率在 87-93% 之间。使用 HPLC 监测视黄醇的浓度，观察到 95% 的回收率（即最终观察到的浓度为 6.7% w/w），如表 1 所示。

表 1：Tagravit™ R1 微胶囊中视黄醇的平均产率 (%)、含量 (% w/w) 和包封率 (%)（平均值 ± 标准差，n=4）。

形态学

所开发出的视黄醇微胶囊呈现为浅黄色的自由流动粉末。使用 SEM 观察微胶囊，证实微胶囊呈球形，如图 1 所示。

图 1：视黄醇微胶囊 (Tagravit™ R1) 的 SEM 显微照片。放大倍数：(A) 5K/标尺 3 µm 和 (B) 0.5K/标尺 10 µm。

粒径

所开发出的视黄醇微胶囊的平均粒径和粒径分布由 HORIBA LA-300 激光衍射粒度分布分析仪（HORIBA Ltd.，日本）测定。粒径分析结果见表 2 和图 2。含视黄醇微胶囊的平均粒径值为 35 ± 5（平均直径 ± 标准差，µm）。单一狭窄峰的存在表明微胶囊群体的尺寸是均匀的。

表 2：按体积计的平均微胶囊粒径和粒径分布（直径，µm，平均值 ± 标准差，n=4）。图 2：Tagravit™ R1 微胶囊平均粒径和粒径分布的代表性图表。

稳定性结果

对包裹视黄醇与游离视黄醇（均掺入局部凝胶基质配方，pH 7.3）的稳定性进行了评估。在 25°C 和 40°C 下评估了每个样品中视黄醇的相对含量（初始含量的 %），如图 3–4 所示。

稳定性结果表明，与游离视黄醇相比，使用包裹视黄醇配方时的平均相对含量显著更高。在 25°C 下储存 550 天的样品获得的结果表明，包裹形式的视黄醇平均含量高于游离视黄醇，分别为初始含量的 49% 和 0%（图 4）。

此外，结果表明，在 25°C 下储存 300 天后，包裹在 Tagravit™ R1 中的视黄醇更加稳定。Tagravit™ R1 微胶囊中视黄醇的平均含量高于裸视黄醇，分别为初始含量的 82% 和 10%。

对凝胶配方中的 Tagravit™ R1 稳定性进行了物理观察，并与游离（未包裹）视黄醇进行了比较。该凝胶加入了 0.1% 的视黄醇（1.45% 的 Tagravit™ R1），在 40°C 下放置 360 天。可以明显观察到，通过加入 Tagravit™ R1 进行配方，防止了凝胶配方的变色。Tagravit™ R1 微胶囊成功地保护了作为化妆品配方活性原料的视黄醇免受氧化和降解。

• 图 3：在 40°C 下储存 100 天后，加入基质凝胶配方 (pH 7.3) 中的 Tagravit™ R1 微胶囊与游离视黄醇的稳定性对比。数据表示为平均视黄醇含量占初始含量的百分比 (n=3)。

• 图 4：在 25°C 下储存 550 天后，加入基质凝胶配方 (pH 7.3) 中的 Tagravit™ R1 微胶囊与游离视黄醇的稳定性对比。数据表示为平均视黄醇含量占初始含量的百分比 (n=3)。

• 图 5：掺入 Tagravit™ R1 微胶囊（左）与裸视黄醇（右）的基质凝胶配方的物理观察。样品在 40°C 下培养 (A) 1 天、(B) 100 天和 (C) 360 天。

体内功效结果

为了评估视黄醇微胶囊对皮肤的功效，使用了人体皮肤快速光学体内表面形貌测量法 (FOITS) 技术。测定了参数 Rz（粗糙度平均深度）和 Ra（算术平均粗糙度）。

图 6 显示了治疗 4 周后每个测试区域 Rz 和 Ra 的平均变化，而图 7 显示了在应用不同治疗 4 周后眼周区域（5 个子区域的平均值）的平均变化。基础晚霜导致粗糙度参数增加了约 3%。

结果表明，与使用基础晚霜治疗的组和未治疗组相比，掺入 Tagravit™ R1 微胶囊的基础晚霜显著降低了约 9% 的 Rz 和 Ra。

图 8 显示了从三个实验组的受试者中获得的与初始值差异的平均绝对深度变化。从使用含 Tagravit™ R1 微胶囊的基础晚霜治疗的受试者中获得的结果显示出积极的效果，因为该治疗引起了微观结构中 FDD 值的增加（约 6%）和粗糙结构中约 12% 的减少。

• 图 6：与未治疗的志愿者相比，使用基础晚霜和掺入 Tagravit™ R1 微胶囊的基础晚霜治疗 4 周 (t4w) 后，区域 1 至 5 的参数 Rz 和 Ra 的平均变化。区域 1 靠近眼睛，区域 5 远离眼睛。

• 图 7：与未治疗的志愿者相比，使用基础晚霜和掺入 Tagravit™ R1 微胶囊的基础晚霜治疗 4 周后，眼周区域（5 个子区域的平均值）参数 Rz 和 Ra 的平均变化。

• 图 8：与未治疗的志愿者相比，使用基础晚霜和掺入 Tagravit™ R1 微胶囊的基础晚霜治疗 4 周后，FDD 与初始值的平均差异 (%)。

结论

虽然视黄醇是护肤品中最受欢迎的成分之一，但它仍然给产品开发人员带来了一定问题，并给护肤配方带来了许多挑战。

为了提高视黄醇的稳定性并确保其有效递送，同时保留其效力和功效，采用溶剂去除法成功制备并生产了商品名为 Tagravit™ R1 的视黄醇微胶囊。Tagravit™ R1 旨在通过机械压力释放视黄醇。涂抹时，在将配方揉入皮肤的过程中，聚合物外壳破裂，微胶囊开始破碎，释放出被包裹的视黄醇。微胶囊分解为肉眼看不见的颗粒，但仍保留一部分有效负载，以随着时间的推移持续递送。

视黄醇微胶囊呈自由流动的粉末状，呈球形，平均粒径约为 35 µm。Tagravit™ R1 微胶囊载有 7% 的视黄醇，包封率为 98%。由于已知视黄醇对光、pH、氧化剂、重金属和空气敏感，因此在配制化妆品时，其稳定性是最重要的因素之一。本研究的结果表明，Tagra Biotechnologies 生产的 Tagravit™ R1 微胶囊在各种配方和条件下均显著比游离形式的视黄醇更稳定。此外，体内临床研究获得的结果清楚地表明，包裹过程确实保留了视黄醇作为抗衰老/抗皱剂的皮肤学活性。

因此，用于视黄醇递送的 Tagravit™ R1 将在发挥其功效方面发挥至关重要的作用，因为视黄醇极不稳定，在暴露于光线和空气时容易降解为无生物活性的形式。

作者地址：Dr. Shaher Dochi and Dr. Danny Goldstein, Tagra Biotechnologies Ltd., Northern Industrial Park Tel-Hai, N. Galilee, 12100, Israel.

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